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潮霉素B的作用机理及生物应用分享
点击次数:124 发布时间:2019-05-23
   潮霉素B Hygromycin B是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。潮霉素B通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因的原核或真核细胞。

  对潮霉素B Hygromycin B的抗性基因:

  对潮霉素B的抗性源自编码潮霉素B磷酸转移酶(Hph)的基因。至今发现两种来源:

  1.Streptomyces hygroscopicus产生的Hph抗性基因;

  2.Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae内质粒携带的Hph抗性基因(常用);

  潮霉素B Hygromycin B的生物应用:

  1) 筛选和维持培养稳定转染Hph+载体的原核细胞或真核细胞(植物细胞和哺乳动物细胞);

  2) 由于作用模式的差异,常与G418 (GeneticinTM),Zeocin™ 和blasticidin S联合使用,筛选稳定转染两个不同载体的细胞株;

  3)抗病毒剂,由于潮霉素B选择性渗透进入病毒感染增强通透性的细胞,而且具有抑制翻译的功效;

  4)作为驱虫药加入动物饲料;

  应用浓度:

  潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型,培养基,生长条件和细胞代谢率而变化。推荐使用浓度为50-1000 μg/mL,浓度需要杀灭曲线来确定。

  哺乳动物细胞·200-500 μg/mL;细菌/植物细胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000 μg/mL;

  潮霉素B Hygromycin B的两种使用方法如下:

  使用一:杀灭曲线确定杀死浓度(仅作参考,因个人检测体系而异)

  (1)往组织培养级的96孔板内加入未转染细胞,细胞密度约50-200细胞/孔;细胞贴壁之后,往每孔加入含不同浓度(如50-1000μg/mL,至少5个浓度)潮霉素B的200μL新鲜培养基;

  (2)37℃,5% CO2培养箱孵育细胞10-14天;

  (3)培养5-7天后更换新的培养液,培养液内含有相应浓度的潮霉素B;

  (4)10-14天后使用细胞增殖方法如MTT,CCK-8等评估细胞活力;也可以通过检测细胞克隆数或百分比汇合率来确定毒性效应。一般选择在10-14天能够杀死所有细胞的最小浓度为筛选浓度。

  使用二:筛选稳定转染细胞

  (1) 对于贴壁细胞,直接吸去60mm培养皿内的转染细胞培养基,然后加入含有潮霉素B的新鲜培养基5-6ml;对于悬浮细胞,无菌条件250x g,离心10min除去旧的转染细胞培养基,然后悬浮在约5ml的含潮霉素B的新鲜培养基;

  (2) 5-7天后,如上方法更换含有潮霉素B的新鲜培养基;

  (3) 再孵育细胞5-7天;

  (4) 10-14天孵育后,培养体系中只含有能够表达潮霉素B抗性表型的活细胞。因此筛选之后如步骤一,更换不含潮霉素B的新鲜培养基。

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